流式細(xì)胞術(shù)檢測時的樣品制備方法

  （一）直接免疫熒光標(biāo)記法
  取一定量細(xì)胞（約1X106細(xì)胞／ml），在每一管中分別加入50μl的HAB，并充分混勻，于室溫中靜置1分鐘以上（）,再直接加入連接有熒光素的抗體進(jìn)行免疫標(biāo)記反應(yīng)（如做雙標(biāo)或多標(biāo)染色，可把幾種標(biāo)記有不同熒光素的抗體同時加入），。孵育20-60分鐘后，用PBS（pH7．2—7．4）洗1-2次，加入緩沖液重懸，上機(jī)檢測。本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，易于分析，適用于同一細(xì)胞群多參數(shù)同時測定。雖然直標(biāo)抗體試劑成本較高，但減少了間接標(biāo)記法中較強的非特異熒光的干擾，因此更適用于臨床標(biāo)本的檢測。
  （二）間接免疫熒光標(biāo)記法
  取一定量的細(xì)胞懸液（約1X106細(xì)胞／ml），先加入特異的*抗體，待反應(yīng)*后洗去未結(jié)合抗體，再加入熒光標(biāo)記的第二抗體，生成抗原—抗體—抗抗體復(fù)合物，以FCM檢測其上標(biāo)記的熒光素被激發(fā)后發(fā)出的熒光。本方法費用較低，二抗應(yīng)用廣泛，多用于科研標(biāo)本的檢測。但由于二抗一般為多克隆抗體，特異性較差，非特異性熒光背景較強，易影響實驗結(jié)果。所以標(biāo)本制備時應(yīng)加入陰性或陽性對照。另外，由于間標(biāo)法步驟較多，增加了細(xì)胞的丟失，不適用測定細(xì)胞數(shù)較少的標(biāo)本。
二、zui小化非特異性結(jié)合的方法
1．熒光標(biāo)記的抗體的濃度應(yīng)該合適，如果濃度過高，背景會因為非特異性的相互作用的增加而增加。
2．在使用*抗體之前，將樣品與過量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脫脂干奶酪，或來自于同一寄主的正常血清來作為標(biāo)記的第二抗體。這個步驟通過阻斷*抗體和細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的非特異性的交互作用來降低背景。
3．在使用*抗體之后，將樣品與5%至10%的來自于同一寄主的正常血清和作為標(biāo)記的第二抗體一起培育。這個步驟會減少不必要的第二抗體與*抗體、細(xì)胞表面或胞內(nèi)結(jié)構(gòu)之間的交互作用。
通過用來自于同樣的樣品的血清稀釋標(biāo)記過的抗體可以略過此步驟。此步驟適用于很多方面，但有時候它也會導(dǎo)致已標(biāo)記的第二抗體和正常血清中的免疫球蛋白的免疫復(fù)合體的形成。這種復(fù)合體會優(yōu)先與一些細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行結(jié)合，或者它們zui終會導(dǎo)致期望得到的抗體活性的丟失。
4．使用F（ab’）2片段會使背景決定于*或第二抗體與FC受體的全分子結(jié)合。大多數(shù)的第二抗體的F（ab’）2片段容易利用。而*抗體的F（ab’）2片段一般是不能利用或很難制作。因此，在NaN3存在的條件下，將新鮮組織或細(xì)胞與正常血清一起培育應(yīng)選擇優(yōu)先加入*抗體。在此情況下，即使在隨后的步驟中用完所有的抗體分子，F(xiàn)C受體決定的背景影響已不再重要。
5．其它：已標(biāo)記的抗體和其他一些內(nèi)在的免疫球蛋白或加入實驗系統(tǒng)中的其它物質(zhì)的交叉反應(yīng)也可能會有背景影響。為了降低背景，在多重標(biāo)記過程中，所有的已標(biāo)記的抗體應(yīng)被吸附，避免其他種類蛋白的交叉反應(yīng)。